Apsorbanca (UV-VIS)

Shema i načelo rada UV-VIS spektrofotometra

• Izvor zračenja (lamp)
  • može biti vodikova, živina ili volframova lampa
• Monokromator (monochromator)
  • optička prizma ili rešetka s ulaznom i izlaznom pukotinom te propušta samo jednu valnu duljinu svjetlosti koja na njega pada
  • Biranjem upadnog kuta svjetla koje pada na optičku prizmu ili rešetku može se odabrati valna duljina svjetla koju će monokromator propustiti prema testiranom uzorku
• Nosač uzorka (sample cuvette)
  • uzorak je smješten u prozirnoj posudi (kiveti) koja ja najčešće širine 1 cm i načinjena je ili od kvarcnog stakla koje propušta UV-VIS zračenje ili običnog stakla (propušta se samo VIS zračenje, ali ne i UV zračenje!)
  • otapalo koje se koristi za pripremu uzorka općenito ne smije apsorbirati UV-VIS zračenje, a najčešće se koriste otapala: voda, etanol, heksan i diklormetan

Spektrofotometar

Uređaj koji mjeri intenzitet svjetla koje je prošlo kroz analizirani uzorak (I) te ga uspoređuje s intenzitetom upadnog svjetla (I0). Odnosno, prolaskom UV-VIS zračenja kroz otopinu uzorka, dio energije zračenja se apsorbira (A), a dio biva propušten (količina propuštenog zračenja definira se tzv. transmitancijom T, veličinom suprotnom od apsorbancije!).

Apsorpcija zračenja dana je Lambert- Beerovim zakonom, tako da se koncentracija analizirane tvari može odrediti upravo iz tog zakona prema izrazu:

 A =  log(I₀ / I) = ε c L

Gdje je:

• A – apsorbanca
• I₀ – intenzitet upadnog svjetla (ulazne zrake), nakon prolaska kroz sl. probu
•  ε – ekstinkcija – molarni apsorpcijski koeficijent (L / cm x mol); mjera za intenzitet koliko je snažno neka molekula apsorbirala zračenje pri određenoj valnoj duljini!
• c – koncentracija analizirane tvari (mol/L)
• L – duljina ćelije, tj. kivete (cm)

Uzorak je apsorbirao zračenje kada je intenzitet zrake koja je prošla kroz uzorak (I) manji od intenziteta ulazne zrake (I₀)  i omjer I₀ / I veći od 1.

Kada je omjer I₀ / I = 1, apsorbanca je A = 0, tj. tada nema apsorbance.

Opširnije – za one koji žele znati nešto više:

Elektromagnetsko zračenje (E = h x v; v = c / λ) karakterizirano je valnom duljinom λ (nm) te frekvencijom ν (Hz), dok je sama frekvencija (v) definirana omjerom brzine svjetlosti (c = 108 m/s) i valne duljine (λ).
Sunčevo (bijelo) svjetlo sastoji se od: ultraljubičastog dijela (UV), vidljivog dijela (VIS) te infracrvenog dijela (IR) elektromagnetskog zračenja.

UV (blisko) zračenje pokriva valne duljine u rasponu: 290 – 380nm, dok vidljivo VIS (od engl. visible) zračenje pokriva valne duljine u rasponu: 380 – 800nm. UV-VIS spektrofotometri operiraju uglavnom unutar područja valnih duljina 200 – 800nm.

Spektroskopske instrumentalne metode služe za proučavanje atomske i molekulske strukture spojeva, a baziraju se na interakciji elektromagnetskog zračenja s uzorkom, pri čemu ispitivana tvar emitira (apsorbira) točno određenu količinu zračenja koja se onda mjeri. Tako nastali emisijski (apsorpcijski) spektri karakteristični su za određenu ispitivanu tvar.

Zapravo UV-VIS zračenje u molekuli (točnije u dijelu molekule) uzrokuje pobuđivanje, tj. prijelaz elektrona iz nižih u više nepopunjene orbitale.

Razlikujemo 3 tipa elektrona: σ, π i n elektroni.

• σ – to su elektroni koji su uključeni u zasićene σ –veze, odnosno nema slobodnih elektronskih parova (zasićeni ugljikovodici). Oni da bi došli u pobuđeno stanje zahtijevaju puno višu energiju (s nižim valnim duljinama < 150nm), nego što je to energija UV-VIS zračenja pa stoga spojevi koji sadrže zasićene veze ne apsorbiraju ovo zračenje.
• π – to su elektroni koji su uključeni u nezasićene π – veze ugljikovodika, a prisutni su npr. u konjugiranim sustavima(dienima, trienima i aromatskim spojevima). Za ove spojeve energija koje posjeduje UV-Vis zračenje je dovoljna da budu vidljivi u tom području.
• n – ovo su tzv. „slobodni ili nevezani elektroni“ koji nisu uključeni u veze između atoma, a sadrže ih organski spojevi koji sadrže atome sa nevezanim elektronskim parovima (kisik, dušik, halogeni: Cl, Br, I). Ovi spojevi zahtijevaju najmanju energiju (izrazito u VIS području, dok u UV području ipak pokazuju nešto slabije vrpce!)

Dio organske molekule s nezasićenim funkcionalnim skupinama (>C=O,
>C=C<, ‒N=O, ‒C≡C‒ i druge) koji je apsorbirao određenu količinu zračenja
naziva se kromofor, dok se funkcionalna grupa s jednim ili više nesparenih
elektronskih parova naziva auksokrom. S obzirom da mnoge organske
molekule sadrže više od jednog kromofora molekula može dati više od jedne
vrpce u UV spektru.

Dakle, općenito se može reći – što je spoj zasićeniji, tj. ako sadrži manje nezasićenih, dvostrukih i trostrukih veza apsorpcijski maksimum se pomiče ulijevo (prema nižim valnim duljinama, odnosno većoj energiji – hipsokromni pomak).

Nasuprot tome, spojevi koji imaju više nezasićenih (dvostrukih i trostrukih) veza te isto tako slobodnih, nevezanih elektrona, apsorpcijski se maksimumi pomiču više udesno prema većim valnim duljinama, odnosno prema nižoj energiji (batokromni pomak). Npr. svaka dodatna dvostruka veza u konjugiranoj molekuli pomiče apsorpcijski maksimum oko 30nm prema višim valnim duljinama, tj. prema nižoj energiji zračenja

Treba napomenuti i to da se apsorpcijski maksimumi mogu pomicati i podešavanjem pH vrijednosti otopine analita. Kada se zalužuje, tj. dodaje hidroksidne ione, atom kisika sadrži slobodne elektronske parove koji onda pomiču apsorpcijski maksimum udesno, prema nižoj energiji (većim valnim duljinama).

Primjena UV-VIS spektrofotometrije

Kvalitativna ispitivanja – prema određenom zahtjevu i pri tome

• definirana je jedinična vrijednost valne duljine apsorpcijskog maksimuma (uz propisano max. dozvoljeno odstupanje ± 2nm)
• omjer apsorbanci mora biti definiran na različitim valnim duljinama
• definirana je specifična apsorbanca (A ^1%_1cm λ (nm))

Specifična apsorbanca

A^1%_1cm  λ (nm) – to je apsorbanca otopine koja u 100ml sadrži 1g tvari (1%), a debljina sloja (kivete) je 1cm mjereno pri određenoj valnoj duljini λ.

Ukoliko nije drugačije propisano mjerenja se uvijek provode u istom otapalu ili smjesi otapala.

Ispitivanje čistoće sirovina – prema određenom zahtjevu i pri tome:

• ispitivano onečišćenje i ispitivana tvar imaju apsorpcijski maksimum na različitim valnim duljinama ili različitu specifičnu apsorbancu na istoj valnoj duljini
• apsorbanca ne smije prijeći određenu vrijednost
• apsorbanca ne smije biti veća od apsorbance poredbene otopine koja sadrži gornju dozvoljenu količinu onečišćenja
• omjer apsorbanci je definiran na dvije različite valne duljine (ispitivana tvar, onečišćenje)

Kvantitativna analiza – može se provesti na nekoliko načina

• pomoću specifične apsorbancije:  c (%) =  A / (A ^1%_1cm  x  l (=1cm) )
• pomoću kalibracijske krivulje (baždarnog pravca) pri čemu se kalibrac. pravac priprema pomoću poredbenih (standardnih) otopina. Dobije se linearan odnos (tj. pravac) izmjerene apsorbance i koncentracije pripremljenih standardnih otopina. Sadržaj (koncentracija) ispitivane tvari odredi se interpolacijom pomoću dobivenog baždarnog pravca